謎一樣的單域抗體藥物KN035（上）

      關于單域抗體的概念本文不想累述。有關內容可以參見康寧杰瑞網站

作為小分子抗體的單域抗體有著與完整抗體同等的與抗原的結合能力，以及穩定性。按照教科書式的說法，單域抗體有如下優勢：分子量小，組織滲透力強，可溶性好，有較好的與抗原結合的能力，穩定性好等特點。

有了上述優勢，單域抗體從1993年被發現到現在，被廣泛的應用于靶向引導劑，化學傳感器，診斷試劑等特點，但是作為治療性藥物，雖然目前已有一些項目進入臨床研究階段，但未有成功上市的案例。

做為治療性藥物，單域抗體相對于傳統抗體具有更快的血清清除速率，腎小球濾過率高，很容易被機體清除，其半衰期很短等缺點。因此，人們通過采用基因工程的方法將單域抗體與血清白蛋白，血清白蛋白的納米抗體，免疫球蛋白，免疫球蛋白的Fc片段融合等方案來設法延長單域抗體在血清中的半衰期。此外，由于VHH僅為一個重鏈可變區，人們會構建其多價抗體或者雙特異性抗體的方法來提高其親和力或增加其功能。

圖1傳統抗體與重鏈抗體以及單域抗體的區別（來自http://www.genscript.com.cn）

如下圖所示。首先免疫文庫的構建，噬菌體展示和先導抗體篩選是早期的重點工作。其后較為關鍵的是表達載體的構建、穩定細胞株的選擇、抗體純化以及后繼相關藥學研究的工作，如果涉及抗體結構改造（如構建雙特異性抗體/人源化修飾或為延長半衰期的結構修飾）的話，篩選菌株和抗體優化的工作量也是巨大的。

圖2 單域抗體藥物開發一般流程（來自http://www.genscript.com.cn）

這個問題是最早讓本喵困惑的。在Cell Discovery的那篇文章發表之前，筆者根據康寧杰瑞的有關專利（申請號CN201510465481），明確披露KN035是Hu56V2-Fc，其約360個氨基酸組成，序列中包含單域抗體部分128個氨基酸。具體的氨基酸序列如圖1中序列No：48，這里的Hu56V2-Fc是1個VHH肽鏈與1個Fc片段的肽鏈單體連接。

圖3 （來自專利申請號CN201510465481）

由于引入Fc段融合蛋白，兩條Fc肽鏈容易形成同二聚體，期間到底是由非共價鍵形式聚合？還是形成二硫鍵？專利說明書中提到“可以…形成二聚體”，更進一步的內容沒有看到有具體描述。

圖4（來自專利申請號CN201510465481）

而發表在Cell Discovery的文中明確指出KN035-Fc是二價抗體，看圖5。

圖5 （來自Drug Discovery Today 21(7).July 2016)

KN035到底是圖8左邊的結構，還是右邊的結構呢？抑或還形成了以非共價鍵形式結合的二聚體？如果Fc融合蛋白之間的肽鏈形成了二硫鍵，那么整個KN035就是以二聚體的形式存在，才是Cell Discovery文獻上所表述的“bivalent”二價抗體？

通過仔細看KN035的制備過程：先用pCDNA4（在文章中闡述的是pcDNA3.1）構建質粒，然后通過哺乳動物細胞HEK293表達（如圖6-7），由此推斷，KN035的Fc片段通過二硫鍵連接形成二聚體應該是有可能的?？上壳肮_的資料中并沒有關于鑒定其二聚體結構的實驗，所以本喵也只能從片言只語中臆測KN035可能是形成了完整的二硫鍵，是以二聚體形式存在（如圖8-b）。果真如此，KN035的實際分子量已接近70KD，遠超普通單域抗體15KD的大小。

圖6（來自Drug Discovery Today 21(7).July 2016)

圖7（來自專利申請號CN201510465481）

作為一只好奇害不死的貓，本喵從專利和Cell Discovery文獻中發現其只僅僅提到HEK293。HEK293難道就是康寧杰瑞提交的申報資料中KN035的生產工藝用到的細胞嗎？

做抗體產業化工藝研究的人都知道，目前已經上市的單克隆抗體藥物絕大部分都采用CHO作為工程細胞，而HEK293適合大規模工業化生產的細胞株很少，國內尚未有商業化引進，普遍都是適合實驗室快速制備mg級樣品所用的細胞株。這意味著很可能申報的生產工藝還是CHO？還是如康寧杰瑞官網“大分子工藝平臺”一欄中的描述（如圖9)已經掌握了HEK293大生產的核心技術？康寧杰瑞的HEK293平臺抑或已經可”產業化”了?

圖9（來自康寧杰瑞官網）

具有產業化價值的“工程細胞系”不僅要求能夠正確表達重組抗體，用于抗體藥物生產的“工程細胞”系還需具備以下特性：生長特性良好；異源蛋白表達能力強（20~70 pg/cell/dayPCD），具備正確的翻譯后修飾能力；宿主及重組細胞系遺傳背景清晰、表型穩定，符合相關法規要求。所以獲得穩定可靠高表達的細胞株是做抗體生產工藝研究者追求的目標。雖然有江湖傳言KN035還是采用CHO作為工程細胞，盡管如此，本喵挺佩服這個團隊篩選細胞株的效率的。根據推算，2013年他們放棄PD1的項目，轉而開展PD-L1項目，從2015年申請專利到2016年5月遞交臨床申請，短短時間里就完成了從HEK293到CHO的切換（一般工程細胞篩選都要至少一年以上哦）。本喵期待公開的進一步消息。

已上市的羅氏PD-L1抑制劑，TECENTRIQ的推薦劑量是1200 mg，每次靜脈輸注60min，每3周一次。相比于TECENTRIQ，KN035采取皮下注射的方案從提高患者順應性來說有一定的臨床優勢，有可能成為患者自我管理的給藥方式。根據公開資料，KN035的溶解性相當好，其設計的200mg/ml的藥物濃度，自稱是“創造了生物藥物中濃度最高的制劑”。然而長期皮下注射，其皮膚的刺激性以及免疫應答效應還是值得繼續觀察的。從公開資料看，康寧杰瑞設計KN035皮下注射制劑， 如果按照專利所述劑量，1mg/kg進行給藥，（每周給藥一次）。按標準體重人折算，每人份每周應為約70mg。按照4次為一個給藥周期的話，每個周期的用量達到280mg，這對將來項目設計生產產能來說也是有相當大的壓力。

根據披露的Phase I 臨床試驗方案，2017年3月recieved的DoseEscalation Study試驗設置了六個劑量組來測KN035的安全性和劑量耐受性，比專利中提到的藥效最佳劑量1mg/kg，向下再設計了兩個劑量0.1mg/kg, 0.3mg/kg；而早先2016年6月的DoseEscalation Study of The Safety and Pharmacokinetics試驗只設置了四個劑量組，1、2.5、5、10mg/kg。如圖10（此處本喵忍不住又多想了一下）

圖10（來自Clinnicaltrial.gov）

人體免疫系統相當復雜，抗體的劑量是通過一期臨床試驗決定的，無論給藥量高或者低，都是通過試驗結果分析得來的，我們無法通過機理來推測，有時候也很難基于已有的知識來解釋。比如BMS的Urelumab，早期試驗由于毒性太大已經失敗的項目，后來將劑量減低了10倍之后效果相當好。

將抗體靜脈注射改為皮下注射的案例還是有的。例如羅氏公司采Halozyme公司的透明質酸酶的重組蛋白rHUPH20，能降解類似透明膠的細胞組織空間。在注射郝賽汀的同時，聯合注射rHUPH20可以提高5倍以上的劑量，通過皮下注射，原來5～10毫升的注射量可以改為1～2毫升。2013年郝賽汀皮下制劑在歐盟獲批。研究數據表明，使用赫賽汀皮下制劑的療效與靜脈使用相仿，藥物血漿水平也不低于后者（ClinicalTrials.gov 標識號 NCT00950300）。

以下內容（未完待續），盡請繼續關注。