AET2016現場速遞三：Epitope or Affinity？瀏覽數:229次
華人抗體協會成立大會暨第一次年會將于2017年4月30日在美國馬塞諸塞州劍橋市(Cambridge,MA)召開，會議詳情將陸續在協會的公眾號發布。 華人抗體協會原創系列：協會動態 在抗體開發中，該如何選擇和平衡affinity（親和力）和 epitope（表位）？Antibody Engineering and Therapeutics 會議第三天，Dimiter Dimitrov談到了抗體親和力和表位對CAR-T， ADC類藥物efficacy的影響。由于這個問題在抗體研發中很常見，所以本文將對這個問題做一些詳細的報道。
Senior Investigator Cancer and Inflammation Program Head, Protein Interactions Section, NIH Dr. Dimitrov的研究領域主要包括抗體庫展示篩選方法開發，抗體工程，蛋白生物化學，結構生物學，計算機輔助生物學，以及病毒，免疫，腫瘤生物學。 Epitope和Affinity對 CAR-T efficacy的影響 1. 不同Epitope 對CAR efficacy的影響 抗體binding epitope對CAR 的efficacy是有影響的。在Haso et al的一項研究里，他們使用了來自于兩種anti-CD22 抗體（m971和 HA22SH）的scFv構建CAR。HA22SH和m971的 binding epitope不同（圖一），m971的結合表位更接近細胞膜(membrane-proximal epitope)。兩種抗體的親和力也不一樣，HA22SH的Kd為2.3nM，m971的kd為47nM。但是在體外和體內試驗中，m971 CAR的療效都比HA22SH CAR的療效更好。圖二是用上述兩種CAR在NSG小鼠中做的efficacy試驗。Day 0：i.v. 注射NALM6-GL細胞。Day 3：每只老鼠接受1E+7 HA22SH-28z CAR，等量的m971-28z CAR，或者mock T 細胞。IVIS bioluminescence imaging：Day 3 治療之前，Day 7 和Day 15 治療之后。由圖二可見m971-28z的療效顯著優于HA22SH-28z。
Haso等人對比了上述兩種CAR和CD19-28z CAR（由FMC63 scFv構建而來）的體外活性。CD19比較小，所以anti-CD19 FMC63 scFv 的binding epitope 相當于membrane-proximal epitope（圖一）。他們發現m971-28z的體外活性和CD19-28z的體外活性相當，兩者均比HA22SH-28z的體外活性好。（圖三） 圖三. （圖片摘自于Haso et al. Blood, 2013） 2. 相同Epitope, 不同antibody affinity對CAR efficacy的影響 在另一項研究中，Lynn et al對比了兩種有overlapping epitope的CAR。其中HA-FRb scFv的親和力為2.48nM，LA-FRb scFv的親和力是54.3nM。研究發現，高親和力的HA-FRb CAR的體外和體內活性均比低親和力的LA-FRb CAR要好。（圖四）
值得注意的是，overlapping epitope的情況下，提高affinity可能會相應地提高CAR efficacy，但是當affinity達到一個程度以后，再提高affinity，不一定會有相應的efficacy的提高，這種情況被稱為affinity threshold。比如，Chmielewski et al 在2004年發表在J of Immunology上的一項研究中，使用了一系列的anti-ErbB2 scFv構建CAR。這些scFv的親和力在3.2E-7到1.5E-11 M之間 。研究發現，當抗體親和力達到一定程度后（Kd<1E-8 M），親和力繼續提高對in vitro efficacy沒有顯著影響，而且這些不同親和力的CAR在不同ErbB2 expression level的細胞上的efficacy也很相近。但是低親和力的CAR（Kd>1E-8 M）和高親和力的CAR （Kd<1E-8 M）的效果卻有明顯差別。具體結果見圖五。圖五：不同affinity的CAR對不同ErbB2 expression level 細胞的lysis。紅色數字是5個scFv的Kd （M）。
基于上述試驗結果，Dimitrov在會議上分享了他總結出的epitope和affinity對CAR-T efficacy的影響： ? 抗體親和力和CAR efficacy相關性取決于binding epitope。 ? 如果兩個抗體的binding epitope不同，則這兩種抗體的親和力高低和他們對應的CAR的efficacy的好壞沒有必然關系。 ? 如果兩種抗體擁有overlapping epitope，則抗體親和力和CAR療效可能會有一定相關性。 ? 當親和力提高到一定程度（threshold）之后，再提高親和力不一定會提高efficacy。
ADC efficacy的影響 會議中Dimitrov簡要介紹了一些ADC類藥物中epitope和affinity對efficacy的影響。在Feng et al的一項研究中，m900 和m906是兩個anti-CD56抗體。m906的binding epitope是membrane distal domain，m900的binding epitope是membrane proximal domain。兩個抗體的親和力相近：m906是4.5nM，m900是2.9nM。Feng et al將這兩種抗體分別構建成pyrrolobenzodiazepine dimer （PBD）的antibody-drug conjugate。結果發現m906的in vitro cytotoxicity 明顯優于m900（圖六），其中一個重要原因是m906的internalization比m900更好。這項研究表明，某些情況下，選擇membrane distal epitope對于某些ADC類藥物可能更佳。Dimitrov認為，對于ADC類藥物，如果抗體的親和力（affinity）相近，不同的表位，不同的avidity，和不同的internalization 可能也會造成ADC的efficacy不同。
Dimitrov 講到，epitope為什么影響CAR和ADC的具體原因尚不清楚，可能和cell signaling events有關。上述結果說明，在篩選抗體的過程中，需要平衡affinity和epitope的選擇。根據筆者所在的實驗室的經驗，在抗體初期篩選中，最好能篩選出多個不同epitope的抗體作為parental clone。另外，抗體epitope的選擇也可以參考現有的針對同樣target antigen的比較成功的抗體的epitope。另一方面，ADC類的藥物種類相當多，對于需要在細胞內發揮作用的ADC來說，internalization 是比affinity更重要的一個因素。 但是，對于某些ADC類藥物（比如PE38 immunotoxin），僅僅有好的internalization并不代表一定會有好的efficacy。因為PE38 immunotoxin這類藥物需要efficient translocation from endoplasmic reticulum (ER) to cytosol才能很好地發揮作用。因此，對于不同的format可能需要更細致考慮。 撰寫與編輯：華人抗體協會
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